酪氨酸酶及其抗体与自身免疫性白癜风

     查摘要　酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，可能是白癜风自身免疫的重要抗原。近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据。酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的一个指标。
     关键词：酪氨酸酶　抗体　白癜风

      酪氨酸酶（TYR）是一种75kD含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。Spritz等[1]证实人TYR是一种铜结合蛋白，有铜A和铜B位点。离子铜特异性能与人TYR结合，一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合。组氨酸在铜B位点协调其结合。TYR的多肽链的适当折叠对铜结合及其催化活性是关键性的，TYR突变可中断铜结合使其催化活性丧失。眼、皮肤白化病是由于TYR基因突变所致，该病TYR阳性患者色素性皮肤损害发生率高[2]。超氧化物负离子（O2-）能穿透黑素细胞（MC）入胞内，TYR通过利用O2-保护MC，免受O2-细胞毒作用[3,4]。在黑素瘤患者黑素瘤 细胞（MMC）和MC中抗氧化系统失衡，内源性反应性氧生成，细胞内不能抵御内源性超氧化物的攻击[5]。白癜风患者血清中TYR抗体的生成，提示白癜风的发病与自身免疫有关。

     一、酪氨酸酶的抗原性

      酶是多种自身免疫紊乱性疾病的自身抗原[6]，TYR作为抗原必需具备下列条件：①酶活跃性；②免疫原性；③能诱导识别自身的抗体。

      TYR能暴露于免疫系统中，从恶性或正常色素细胞来源的TYR，可以作为自身抗体产物的靶抗原TYR与蛋白酶等无交叉反应，提示抗TYR抗体对TYR是特异性的，MC能表达MHCⅡ类分子，可作为抗原递呈细胞。人MMC能分泌TYR，TYR抗体在黑素瘤患者血清中发现，其它恶性肿瘤患者血清中则没有，提示恶性黑素瘤可产生抗TYR的抗体[7,8]，TYR基因编码抗原能被黑素瘤细胞毒性T细胞（CTL）识别[9]，显示系统免疫系统能对TYR发挥作用[10]。

      哺乳动物黑素生成由多个基因位点共同参与调控。不同位点基因及相关蛋白具有多种特征性结构点（B位点，C位点，S位点和P位点）。哺乳动物色素细胞调节基因有多种，这些基因的 特点是定位于C位点（C-allbino locus），编码TYR。鼠C位点基因长70kb，定位第7号染色体，人C位点基因长50kb，定位11号染色体。鼠及人C位点基因均含有5个外显子和4个内含子。TYR是一种膜糖蛋白，可在MC中特异性表达。B位点（brown locus）基因编码TRP-1（gp75）。鼠B位点基因长18kb，有8个外显子和7个内含子，定位14号染色体。人B位点基因定位第9号染色体。TRP-1能在MC中表达且定位黑素体膜，具酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶活性。S位点（slaty locus）基因编码TRP-2，小鼠S位点基因位于第14号染色体，为多巴色素异构酶。鼠及人P位点（Pmel-17 locus）基因编码stablin蛋白，人及鼠P位点基因定位第10、12号染色体，参与黑素合成终末途径的调节。

       TYR、gp75、TRP-2结构相似，其基因产物有下列特点：①高同源性（氨基酸序列相同40％，相似45％）。②分子量几乎相同。③三级结构有高度保守序列半胱氨酸残基。④具有酶活性铜结合位点。⑤含有跨膜区。

      TYR是黑素合成的关键酶，其已知的氨基酸序列含有一段前导信号肽和一个跨膜结构基元（motif），与黑素体膜上的锚定蛋白（anchorin）相一致。HLA-A2递呈TYR抗原，不同的细胞毒性T淋巴细胞克隆识别具有活性基元的九肽LLAVLYCLL，说明TYR在不同个体的表达呈相当高的同源性。TYR的表达均一性优于TRP-2，表达频率亦较TRP-1高。除CD8+T细胞外，人CD4+T细胞也能特异性识别TYR基因编码的相关抗原。黑素瘤患者中检出TYR，TYR是MMC上的分化抗原。可作为主动免疫的良好抗原靶。TYR既受MHC-Ⅰ限制，又受MHC-Ⅱ限制的黑素瘤共同抗原，诱生的CD8+T细胞和CD4+T细胞均能产生有效的抗肿瘤应答。TRP-1原位杂交证实编码基因位于人第9号染色体q23区，为IgG抗体识别抗原，具有DHI-2羧酸氧化酶活性，非突变型TRP-1抗原可被HLA-A31特异性CTL识别。外源性TRP-1cDNA在MMC等中表达。gp100即MC/MMC特异性蛋白Pmel-17，免疫电镜证实gp100主要位于Ⅰ、Ⅱ期黑素体膜，广泛表达于人MMC（50％）。HLA-A2 MMC的gp100可被自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）识别。识别部位是十肽LLDGTATLRL（aa457-486），从gp100提取的十肽能体外诱导TIL，将TIL细胞与IL-2配伍应用于HLA-A2+黑素瘤患者，可消除自发性黑素瘤的转移灶。

     二、酪氨酸酶抗体

     （一）检测方法：TYR抗体在白癜风患者血清中检出。Song等[11]1994年用细菌合成人TYR，免疫印迹法检测TYR抗体。这种方法相对不敏感且不能定量检测。Baharav等[12]1996年使用蘑菇TYR，ELISA法检测TYR抗体，此法敏感，但所用蘑菇TYR与人TYR同源性低。而Xie等[13]1996年则用人MC提取物作为TYR的来源，免疫沉淀法等检测TYR抗体。Kemp等[14]1997年采用放免法（RIA）检测TYR抗体。近来此法已被用来检测自身免疫性疾病患者血清中的特异性抗体[15-17]。这种方法能敏感定量检测抗体。

     （二）产生、特点、特性：

        1.抗TYR抗体的产生：用人TYR cDNA转染L细胞，获得L-TY细胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY细胞与等量Frend佐剂混合，腹膜内注入有6周鼠龄的雌性C3H鼠体内，每次间隔2周，第3，4次用5×106细胞裂解物与等量Frend佐剂混合免疫动物。第4次注射后3天，抽血，分离血清，同时用未转染L细胞去除非特异反应性成分，结果用人TYR cDNA转染L细胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只对TYR cDNA转染L细胞的鼠血清抗体滴度＞10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠对L-TY细胞无反应性。用L-TY细胞免疫动物获得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC细胞裂解物。免疫沉淀法可见分子量为70kD～80kD的宽幅条带，可能为TYR生物合成中间代谢产物，未转染L细胞，TYR阴性无色素MMC中未见特异性条带。

        2.免疫印迹法检测TYR抗体：用抗TYR血清10-3稀释度，在TYR转染L细胞和有色素MMC可见细胞内颗粒染色，亲代L细胞内无胞内染色，在L-TY细胞，细胞内染色颗粒位于核周和胞质内。无色素MMC，不表达TYR mRNA，无TYR活性，与TYR抗体无相互作用。有色素MMC和培养MC，高度表达TYR活性，黑素形成多，细胞质颗粒深度染色。单克隆抗体TA99能识别TRP-1糖蛋白，TA99能与人有色素MMC表达的TRP-1和转染L-GP细（用编码TRP-1全长cDNA转染鼠L细胞获得）表达的全长人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭实验证实TA99不耗竭能产生分子量为70kD～80kD条带的抗TYR血清，免疫荧光分析抗TYR抗体与TRP-1，TYR L-GP细胞无相互作用，抗TYR抗体不沉淀来自L-GP细胞的TRP-1。

      3.TYR抗体使TYR活性丧失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY细胞裂解物，提示免疫鼠血清能灭活有色素MMC及L-TY细胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，见黑素形成，提示TYR活性恢复，免疫沉淀时如用免疫前血清则无黑素形成[7]。

     三、白癜风

         白癜风与TYR抗体：TYR抗体在白癜风中常常发生。Song等[11]应用免疫印迹法检测了26例白癜患者血清，其中有16例（61％）可与重组TYR特异性结合。26例白癜风患者，有16例（61％）血清TYR抗体阳性，其中7例伴发非胰岛素性糖尿病（IDDM）有4例（57％）、8例伴发桥本甲状腺炎有4例（50％）、3例伴发Grave病有3例（100％）、7例伴发Addison病有4例（57％）阳性。Kemp等[14]应用35S标记人TYR，放免法（RIA）检测白癜风患者血清TYR抗体。在被检测的46例白癜风患者的血清中，5例（10.9％）TYR抗体阳性，20例对照血清及10例桥本甲状腺炎患者血清阴性。Baharav等应用固相ELISA法检测18例白癜风患者（弥漫性7例，局限性1例）血清中的TYR IgG抗体滴度，结果（OD均值）弥漫性白癜风为0.658±0.251，局限性白癜风0.188±0.05，健康对照组0.093±0.049，显示弥漫性白癜风TYR IgG抗体滴度较局限性白癜风及健康对照组显著增高。这些TYR抗体与TYR的亲和力高，与b位点基因产物TRP-1没有交叉反应[12]。

        大多数急性白癜风及黑素瘤患者有对MC、MMC的抗体，这些抗体在体外通过补体介导细胞毒作用和抗体依赖细胞毒作用杀伤MC。Cui等检测发现30例黑素瘤患者血清有24例（80％）、29例白癜风患者血清有24例（83％）抗体阳性，而28例对照组只有2例（7％）阳性。人及动物黑素瘤中，白癜风的出现能改变其进程。用MMC免疫动物可诱发白癜风。重组抗MMC抗体对黑素瘤有效[18]。黑素瘤伴发白癜风时预后较好，白癜风患者抗体出现的频率和水平与黑素瘤退变（regression）一致。提示抗白癜风和黑素瘤抗体作用于色素细胞（MC，MMC）上有相同的抗原，并且这些抗原能在MC和MMC上表达[19]。白癜风MC抗体既能溶解MC，致皮肤白斑形成，又能有效破坏MMC；MMC抗体也能与正常MC结合，诱导黑素瘤产生白癜风样白斑，TYR抗体则是二者之间的桥梁。

       白癜风患者血清MC抗体滴度与该病活动性和严重程度密切相关，50％局限性白癜风患者血清中有对MC的抗体，而弥漫性白癜风则高达93％，且弥漫性白癜风MC抗体能与MMC结合，抑制其增殖。在补体存在的情况下溶解细胞，减少体内鼠黑素瘤转移，MMC上抗体表位滴度在白癜风较健康者及黑素瘤高。黑素体是黑素合成和贮存的亚细胞器，Ando等[20]认为黑素体数量变化与TYR mRNA水平有关。UVB上调TYR mRNA水平致皮肤色素沉着[21]。TYR和gp75都是黑素体转膜糖蛋白，TYR抗体与gp75没有交叉反应[22]。

       白癜风患者血清含有抗MC抗体，MC抗体在Smyth鸡模型中于脱色前数周被检测到。近来黑素瘤患者血清中亦分离到TRP-1自身抗体，循环中的这些抗体被认为是导致Smyth鸡色素脱失斑的主要原因[23,24]。白癜风患者血清中TYR抗体的检出，进一步提示白癜风的分子发病机制，为临床分型、分期、治疗及预后提供依据